Mалый практикум по генной инженерии

Т. В. Матвеева, Д. И. Богомаз, Л. А. Лутова

Рекомендовано Учебно-методической комиссиейбиолого-почвенного факультетаСанкт-Петербургского государственного университетав качестве методического пособия для студентов, обучающихся по специальности 020400 — Биология Матвеева Т. В., Богомаз Д. И., Лутова Л. А.М33 Малый практикум по генной инженерии / Т. В. Матвеева, Д. И. Богомаз, Л. А. Лутова. — СПб : Реноме, 2011. — 52 с. : ил. ISBN 978-5-91918-119-4В книге обсуждаются основные методы, используемые в генной инженерии, подробно описан генно-инженерный эксперимент, в ходе выполнения которого студенты могут на практике освоить некоторые способы выделения ДНК, различные варианты полимеразной цепной реакции, лигирования, трансформации бактерий, секвенирования. Пособие предназначено для студентов биологических специальностей.Ил. 19, табл. 3, библиогр. 4.

ВВЕДЕНИЕ

Генетическая инженерия (генная инженерия) — совокупность приё-мов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК,выде ления генов из организма (клеток), осуществления манипуляцийс генами и введения их в другие организмы.Чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по при-ведённой ниже схеме.Из организма (донора нужных генов) экстрагируют нативную ДНК(клонируемая ДНК), амплифицируют необходимый её участок (илиферментативно фрагментируют её) и соединяют фрагмент (при помо-щи фермента лигазы) с другой ДНК (вектор для клонирования) с об-разованием новой, рекомбинантной молекулы ДНК. Вектор для кло-нирования необходим для успешного переноса и поддержания генаинтереса в клетке хозяине. Процесс введения рекомбинантной ДНКв клетку-хозяина (реципиент) называется трансформацией. Далееидентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК.В большинстве случаев конечной целью работы является синтез спе-цифического рекомбинантного белка клетками-хозяевами, однакогенно-инженерные эксперименты могут быть использованы и для из-учения структуры и функционирования последовательностей ДНК.В ходе получения рекомбинантных ДНК их последовательности при-нято периодически проверять. Процесс определения последователь-ности ДНК называется секвенированием.Основными методами генной инженерии являются полимеразнаяцепная реакция (ПЦР), рестрикция ДНК, её лигирование и трансфор-мация бактерий рекомбинантной ДНК. Данный практикум знакомитс указанными методами в ходе постановки цельного генно-инже нер-ного эксперимента. Методическое пособие состоит из двух частей.В первой части даются основные представления о методах геннойинженерии. Вторая часть посвящена описанию эксперимента, в ходекоторого можно освоить описанные методы.

1. ОСНОВНЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕТОДАХ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

1.1. СТРУКТУРА ДНК

Поскольку генно-инженерные эксперименты — это манипуляциис молекулой ДНК, остановимся немного подробнее на её структуре.Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — один из двух типов нук-леиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколенияв поколение и реализацию генетической информации о функциони-ровании живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долго-временное хранение информации о структуре РНК и белков.С химической точки зрения ДНК — это полимер, состоящий измономеров-нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистогооснования, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы (рис. 1).

В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуа-нин, тимин и цитозин) (рис. 2). Связи между нуклеотидами в цепи об-разуются за счёт дезоксирибозы и фосфатной группы.

Рис. 2. Азотистые основания, входящие в состав ДНК

При описании нуклеиновых кислот атомы углерода в азотистыхоснованиях принято нумеровать цифрами, а в пентозе — цифрами соштрихом. К 3’-углероду дезоксирибозы присоединена ОН-группа.За счёт этой группы и одной из кислотных групп остатка фосфорнойкислоты, присоединённого к 5’-углероду, образуется фосфодиэфир-ная связь. В результате получается цепочка, показанная на рис. 3. Каквидно из рисунка, на одном конце цепочки находится свободная фос-фатная группа при пятом атоме пентозы, на другом — пентоза со сво-бодной ОН-группой при третьем атоме углерода. Так что в данном слу-чае принято говорить о 5’- и 3’-концах молекулы, причём первыйсчитается началом цепочки ДНК, а второй — концом.

В подавляющем большинстве случаев ДНК состоит из двух цепей,ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Азотистыеоснования одной из цепей соединены с азотистыми основаниями дру-гой цепи водородными связями согласно принципу комплементар-ности: аденин соединяется только с тимином, гуанин — только с цито-зином. Эта двухцепочечная молекула спирализована. При этом цепиявляются антипараллельными, т. е. 5’-конец одной цепи находится на-против 3’-конца другой цепи. Последовательность нуклеотидов позво-ляет «кодировать» информацию о различных типах РНК, наиболее важ-ными из которых являются информационные, или матричные (мРНК),рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все эти типы РНК синте-зируются на матрице ДНК за счёт копирования последо вательностиДНК в последовательность РНК. Общепринятой формой записи после-довательности ДНК является запись нуклеотидов от 5’- к 3’-концу.При нагревании ДНК водородные связи разрываются, и нити вдвойной спирали расплетаются. Процесс нагревания называетсяплавлением ДНК, при этом разрушаются связи между парами А — Т иГ — Ц. Чем больше в ДНК пар А — Т, тем менее прочно нити связаныдруг с другом, тем легче ДНК расплавить.

1.2. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный методмолекулярной биологии, основанный на многократной ферментатив-ной амплификации целевого фрагмента ДНК, фланкированного синте-тическими олигонуклеотидами.Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 годуамериканский учёный Кэри Мюллис. Впоследствии он получил за этоизобретение Нобелевскую премию. В основе метода ПЦР лежит мно-гократное удвоение выбранного исследователем участка ДНК. В ре-зультате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуаль-ной детекции.Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить мно-жество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введениему таций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в би о-логической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), установления отцов-ства, клонирования генов, выделения новых генов.Для того чтобы провести ПЦР, в микроцентрифужной пробиркесмешивают ДНК-матрицу, праймеры (ДНК-затравки), нуклеотиды, ДНК-полимеразу, буфер для фермента. Реакция идёт в водном растворе.Праймеры — это небольшие фрагменты одноцепочечной ДНК,комплементарные участкам разных цепей матрицы, расположеннымна небольшом (обычно 100–2000 п. н.) расстоянии друг от друга (рис. 4).Как правило, праймеры представляют собой последовательностидлиной 20–24 нуклеотида. При этом рекомендуют подбирать их такимобразом, чтобы их ГЦ-состав (процент гуанина и цитозина) составлялот 40 до 60%. Праймеры получают путём химического синтеза. В боль-шинстве случаев генные инженеры самостоятельно подбирают по-следовательности праймеров, а их синтез заказывают в биотехнологи-ческих фирмах. Важно учитывать тот факт, что обычно химическисинтезированные фрагменты ДНК (в отличие от природных) на 5’-кон-це не имеют фосфата.Реакция ПЦР состоит из нескольких десятков циклов, в ходе каждо-го из которых выделяют три этапа.Первый этап — денатурация ДНК. Он осуществляется при нагрева-нии реакционной смеси до +93 – +95° С. На этом этапе разрываютсяводородные связи между азотистыми основаниями. Как следствие,цепи ДНК перестают удерживаться друг около друга.

Рис. 4. Расположение праймеров на ДНК-матрице

Второй этап — отжиг праймеров. Важнейшая характеристика прай-меров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица.Она определяется как температура, при которой половина сайтов свя-зывания праймера занята. Tm можно приблизительно определить поформуле: Tm = 2(A + T) + 4(G + C). Если праймер короткий, а Tm мала, топраймер может оказаться частично комплементарен другим участкамматричной ДНК, что может привести к появлению неспецифическихпродуктов. Сверху температура плавления ограничена оптимумомдействия полимеразы.Третий этап — элонгация (удлинение цепочки ДНК). После гибри-дизации матрицы с праймером (отжиг) последний служит затравкойдля ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы(рис. 5).

Рис. 5. Стадии одного цикла ПЦР

В ходе одного цикла ПЦР количество фрагмента, ограниченногомес тами отжига праймеров увеличивается в два раза. За N цикловреакции количество амплифицируемого фрагмента увеличиваетсяв 2N раз.В настоящее время в ПЦР в подавляющем большинстве случаев ис-пользуют ДНК-полимеразу термофильной бактерии Thermus aquaticus(Taq-полимераза), выделенную и охарактеризованную в 1980 годусовет скими учёными А. С. Калединым, А. Г. Слюсаренко и С. И. Городец-ким из ВНИИ генетики. Температурный оптимум реакции, направля е-мой Taq-полимеразой, находится в районе +70° С. Другим важнымсвойством является то, что данная полимераза не инактивируется по-сле длительной инкубации при +95° С. Используя Taq-полимеразу, уда-лось решить сразу две проблемы. Во-первых, термостабильная поли-мераза не инактивируется на этапе денатурации ДНК, поэтому нетнеобходимости после каждого цикла реакции добавлять новую пор-цию фермента. Это упрощение процедуры позволило автоматизиро-вать проведение ПЦР, так как теперь требовалось лишь перенести об-разец с определённым интервалом времени в разные температурныеусловия: +90 – +95° С (температура денатурации) и +50 – +72° С (темпе-ратура ренатурации ДНК и ферментативной реакции). Во-вторых, вы-сокий температурный оптимум реакции, катализируемой Taq-полимеразой, позволяет подбирать жёсткие температурные условияотжига, обеспечивающие гибридизацию праймеров только в задан-ном районе изучаемого генома, что существенно повышает специфич-ность и чувствительность метода. Однако у Taq полимеразы есть исвои недостатки, например, сравнительно низкая точность, а такжеспособность добавлять аденозинмонофосфаты к 3’-концу ДНК.Кроме Taq полимеразы в настоящее время используют и другиетермостабильные полимеразы. В частности, это термостабильная по-лимераза Pfu из Pyrococcus furiosus, характеризующаяся высокой точ-ностью и синтезом фрагментов с тупыми концами.Продукты реакции разделяют в агарозном геле и визуализируют,окрашивая бромистым этидием. Бромистый этидий, взаимодействуяс ДНК, приводит к её флуоресценции при облучении ультрафиолето-вым светом.В генной инженерии ПЦР используют для амплификации фрагмен-тов ДНК, на основе которых получают рекомбинантные молекулы, а также для контроля присутствия целевой последовательности ДНКв исследуемых образцах.Кроме классических вариантов ПЦР в современной молекулярнойбиологии используют ПЦР в реальном времени. Эта группа методикоснована на использовании флуоресцентных красителей, интенсив-ность свечения которых (репортёрная флуоресценция) пропорцио-нальна количеству образуемого продукта ПЦР. Такой подход даёт воз-можность опосредованно оценить выход продукта реакции послекаждого цикла амплификации, построить по полученным данным ки-нетическую кривую ПЦР и определить относительную концентрациюсубстрата на основании анализа этой кривой.Амплификаторы для ПЦР в реальном времени снабжены оптиче-ским блоком. Его функцией является облучение пробирок, в которыхидёт ПЦР, светом определённой длины волны и детекция испускаемойобразцами флуоресценции в другой области спектра в ходе реакции.Большинство современных амплификаторов для ПЦР в реальном вре-мени имеют четыре-пять флуоресцентных каналов. Существует дверазновидности ПЦР в реальном времени, различающиеся по природегенерирования репортёрной флуоресценции.Первая разновидность основана на использовании интеркалирую-щих красителей. Наиболее распространённым среди них являетсяSYBR Green. Этот краситель — исключительно чувствительный флуо-ресцентный индикатор двухцепочечной ДНК. Иными словами, интен-сивность свечения красителя тем выше, чем больше в пробе концен-трация двунитевой ДНК. Максимум флуоресценции в комплексе с ДНКсоставляет 521 нм, максимум возбуждения — 497 нм.Вторая разновидность ПЦР в реальном времени основана на ис-пользовании флуоресцентно-меченых зондов. Наиболее распростра-нённым типом зондов являются зонды Taqman. Они содержат наодном конце флуоресцентный краситель, а на другом — гасительфлуоресценции. Зонды должны быть подобраны так, чтобы они отжи-гались на ДНК-матрицу между сайтами отжига праймеров, а темпера-тура плавления зондов должна быть приблизительно на 10° С выше,чем праймеров. Действие зондов основано на том, что изначальнофлуоресцен ция красителя подавляется гасителем флуоресценции,находящимся достаточно близко (в составе одного зонда). В ходе ре-акции зонд отжигается между праймерами. Taq-полимераза обладает 5’-3’-экзонуклеазной активностью. В ходе наращивания цепи она на-тыкается на препятствие в виде зонда и начинает гидролизовать его.В результате флуоресцентный краситель и гаситель флуоресценцииоказываются разобщёнными. Краситель начинает светиться (рис. 6).Итак, чем больше ПЦР-продуктов образуется, тем больше зондовгидролизуется, тем выше становится уровень флуоресценции.

Рис. 6. Схема одного цикла ПЦР в реальном времени с зондом TaqMan

Чем раньше прибор начинает детектировать рост флуоресценции, тембольше матрицы для ПЦР присутствовало в образце.Кинетическая кривая PCR в координатах «Уровень репортёрнойфлуоресценции — цикл амплификации» имеет сигмовидную форму(рис. 7). В ней можно выделить три стадии:стадию инициации (когда ПЦР-продукты ещё не детектируетсяфлуоресцентной меткой);экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненци-альная зависимость увеличения интенсивности флуоресценции отцикла ПЦР);стадию насыщения, характеризующуюся снижением эффектив-ности реакции с постепенным выходом на плато.

Рис. 7. Кинетическая кривая PCR в координатах

«Уровень репортёрной флуоресценции — цикл амплификации».1 — стадия инициации, 2 — экспоненциальная стадия, 3 — плато.Координаты по оси абсцисс точек пересечения графиков с линией Сосоответствуют значениям пороговых цикловВажным параметром ПЦР в реальном времени является значениепорогового (Со) цикла. Проще всего его определить как цикл, начинаяс которого происходит регистрация накопления продуктов амплифи-кации. Исходное количество ДНК-мишени пропорционально значе-нию порогового цикла. В идеальном случае, если в образце 1 концен-трация ДНК мишени выше в два раза, чем в образце 2, то значениепорогового цикла образца 1 будет на единицу меньше, чем для образ-ца 2. Это связано с тем, что в ходе каждого цикла происходит удвоениепродуктов реакции. Следовательно, в идеальном случае, если значе-ния пороговых циклов между образцами отличаются на величину N,то количество исходной ДНК-мишени различалось в 2N раз.В генной инженерии ПЦР в реальном времени используют, как пра-вило, для количественной оценки экспрессии трансгенов.

1.3. РЕСТРИКЦИЯ

Рестрикцией называют разрезание цепочки ДНК, осуществляемоеспециальным ферментом (рестриктазой).Рестриктазы (рестрицирующие эндонуклеазы, эндонуклеазы ре-стрикции) — это группа ферментов, относящихся к классу гидролаз,катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот. В отличиеот экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты нес конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаётопределённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов ирасщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или за егопределами.В зависимости от симметричности сайта узнавания и местополо-жения разреза относительно сайта узнавания эндонуклеазы рестрик-ции подразделяют на три основных типа (или класса). В генной ин-женерии активно используют рестриктазы второго типа, посколькув отличие от остальных они узнают последовательности, обладающиесимметрией второго порядка, и делают разрез в пределах сайта узна-вания. Это важно, поскольку при молекулярном клонировании нужно,чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строгоопределённых участках (сайтах) с образованием дискретного и вос-производимого набора фрагментов.Названия рестриктазам даются по следующему принципу: род ми-кроорганизма обозначается первой прописной буквой ( EcoRI), а вид —двумя строчными (E coRI); иногда указывают штамм в виде заглавнойбуквы (Eco R I). Римские цифры (EcoR I) — это порядковый номер дан-ной эндонуклеазы в ряду прочих рестриктаз, выделенных из данногомикроорганизма. Например, HраI и НраII — соответственно первая ивторая рестрицирующие эндонуклеазы типа II, выделенные из Haemo-philus parainfluenzae.Рестриктазы II типа узнают последовательности двухцепочечнойДНК длиной 4–8 п. н., имеющие ось симметрии второго порядка —палин дромы (рис. 8).

Рис. 8. Схема палиндрома ДНК

Как видно из рисунка, последовательность при повороте её на180 градусов относительно оси, указанной точкой, совпадёт с исход-ной. От длины сайта узнавания зависит частота его распространенияв моле куле ДНК; в большинстве случаев используют рестриктазы,узнающие тетра- и гексануклеотиды. При этом часть рестриктаз рас-щепляет ДНК строго по оси симметрии, что приводит к образованиюфрагментов ДНК с тупыми концами, не имеющими выступающих одно-цепочечных участков (HaeIII, SmaI). Другие, например EcoRI и PstI, вно-сят разрыв не точно по оси симметрии второго порядка, а в точкахдвух цепей ДНК, отстоящих друг от друга на четыре нуклеотида. В ре-зультате такого разрыва образуются фрагменты ДНК с выступающимилипкими 5’-концами (EcoRI) или 3’-концами (PstI) (рис. 9).

Рестриктазы являются ферментами, активность которых зависитот состава реакционной смеси и температуры проведения реакции.Фирмы, выпускающие рестриктазы, поставляют и буферные растворы,которые отличаются по рН, концентрации и ионной силе. Для ос-новной массы рестриктаз можно использовать один из выпус каемых буферов. Все необходимые характеристики фермента при водятся наэтикетке, в том числе там указывают активность фермента в разныхбу ферах. Их несколько типов. Некоторые рестриктазы могут рабо-тать в одном и том же буфере. В этом случае с ними можно ставить со-вместную рестрикцию. Если рестриктазы требуют использованияразных буферов, то рестрикцию надо проводить последовательно:сначала рестрицировать одним ферментом, потом пере осадить про-дукты рестрикции, затем поставить реакцию с другой рестриктазой.Оптимальной температурой реакции для большинства рестриктазявляется +37° С, однако существуют рестриктазы, работающие при бо-лее низкой (SmaI предпочитает +25° С) и более высокой температуре(BclI — +50° С, рестриктазы, выделенные из термофильных микроор-ганизмов, например, BsaBI — +60° С, BsmI — +65° С).Необходимо помнить, что объём добавляемого фермента не дол-жен превышать 1/10 объёма реакционной смеси, поскольку избытокглицирина, входящего в состав буфера для хранения фермента, можетингибировать реакцию.Некоторые рестриктазы при работе в неоптимальных условияхмогут менять свою специфичность. Это называется Star-активностьюи отмечается звёздочкой. Например, EcoRI при повышении рН и умень-шении ионной силы буфера вместо последовательности 5’-G AATTC-3’узнаёт последовательность 5’- N AATTN-3’.Рис. 9. Тупые и липкие концы, образующиеся в результате рестрикцииОбычно разные рестриктазы узнают разные последовательности.Однако иногда ферменты, выделенные из разных источников, узна-ют одинаковые последовательности и разрезают их одинаково. Та-кие ферменты называются изошизомерами. Например, BamHI и BstI(G/GATCC), SphI, PaeI, BbuI (GCATG/C). В некоторых случаях рестрикта-зы узнают одну и ту же последовательность, но разрезают в разныхместах — SacI (GAGCT/C) и Ecl136I (GAG/CTC). Это гетерошизомеры.Существуют рестриктазы, которые при расщеплении ДНК образу-ют одинаковые выступающие липкие концы. Когда два образца ДНКобрабатывают разными рестриктазами с образованием фрагментовс одинаковыми липкими концами, а затем смешивают эти образцы, то,благодаря комплементарному спариванию липких концов фрагмен-тов разных образцов, могут образовываться новые комбинации ге-нов. Для полного воссоединения концов ДНК используют лигазы,кото рые будут рассмотрены в следующем разделе.В генной инженерии рестриктазы используют на первом этапе соз-дания рекомбинантных ДНК (для подготовки молекул ДНК к последу-ющему лигированию), а также для проверки структуры рекомбинант-ной ДНК (рестрикционное картирование).

1.4. ЛИГИРОВАНИЕ ГЕНА ИНТЕРЕСА В ВЕКТОР

Лигирование ДНК — то ковалентное сшивание цепей ДНК в ду-плексе при репликации, репарации и рекомбинации. Процесс катали-зируют ферменты-лигазы, которые образуют фосфодиэфирные мости-ки между 5’-фосфорильной и 3’-гидроксильной группами соседнихдезоксинуклеотидов в местах разрыва ДНК или между двумя молеку-лами ДНК. В генной инженерии лигирование — приём, с помощью ко-торого чужеродная ДНК встраивается в вектор.В качестве источника ДНК для встраивания в вектор могут служитьпродукты ПЦР, рестрикции или (реже) продукты неферментативнойфрагментации ДНК.В генной инженерии используют ДНК-лигазы E.сoli и фага Т4. Ониразличаются по потребности в кофакторах — NAD+ (в случае лигазыE.coli) и ATP (фаговая лигаза). ДНК-лигаза фага Т4 катализирует «сши-вание» как липких, так и тупых концов. ДНК-лигаза E.сoli не способна лигировать тупые концы. Поэтому в экспериментах по клонированиюв подавляющем большинстве случаев использют ДНК-лигазу фага Т4.Важно понимать, что клонирование фрагментов, полученных припомощи ПЦР, отличается от клонирования фрагментов, полученныхв ходе рестрикции.Воссоединение фрагментов возможно в случае существования5’-фосфорильной группы на конце одного фрагмента и 3’-гидроксиль-ной группы на конце другого фрагмента. Продукты ПЦР не имеют фос-фата на 5’-конце, поэтому не могут быть залигированы друг на друга,а при их лигировании с фрагментами, имеющими 5’-фосфатные груп-пы, образуются молекулы с однонитевыми брешами.В простейшем случае в генно-инженерных экспериментах лигиру-ют ген интереса в молекулу-вектор. В более сложных случаях реком-бинантные ДНК собирают из множества частей. Такой экспериментпроводят в несколько этапов.Для клонирования фрагментов ДНК используют различные векто-ры, различающиеся по структуре и размерам, но все они должны об-ладать следующими общими свойствами:способностью к автономной репликации в реципиентных клетках при наличии встройки чужеродной ДНК;стабильностью в реципиентных клетках;стабильным поддержанием чужеродной ДНК;наличием уникальных сайтов рестрикции, по которым можно встраивать чужеродную ДНК и которые расположены в области, несущественной для амплификации вектора (удобно, если эти сайты находятся в селективных генах);наличием селективных маркеров, позволяющих идентифицировать клетки, содержащие рекомбинантную ДНК;относительно небольшим размером, позволяющим легко от делять рекомбинантную ДНК от хромосомной ДНК реципиентной клетки.Выбор вектора зависит от того, какого размера фрагмент плани-руется клонировать. Для очень протяжённых фрагментов — более100 т. п. н. используют так называемые искусственные хромосомы(ВАС , bacterial artificial chromosomes), YAC(yeast artificial chromosomes).Для фрагментов размером несколько десятков т. п. н. применяют дру-гие векторы. Векторы на основе фага лябмда предназначены для кло-нирования фрагментов размером 20 т. п. н. Векторы, имеющие черты фага лямбда и плазмид, — космиды используют для клонированияфрагментов размером около 40 т. п. н.Наиболее распространёнными являются плазмидные векторы.В них можно заклонировать фрагменты размером несколько т. п. н.Большие вставки ДНК в векторных плазмидах нестабильны, а клони-рование фрагментов ДНК больше 10 т. п. н. резко снижает эффектив-ность последующей трансформации.В настоящее время для облегчения отбора клонов со вставкамииспользуют селективные системы. Классическим примером такой си-стемы является бело-голубая селекция, реализованная в векторах се-рии pUC, разработанных в Калифорнийском университете (рис. 10).

Рис. 10. Схема работы лактозного оперона

В состав векторов входит регуляторная часть lас-оперона: ген реп-рессора laсI и 5’-концевая часть структурного гена β-галактозидазыE.coli — lacZ’, кодирующая так называемый альфа-пептид β-галак-тозидазы, состо ящий из 145 аминокислот. Этот пептид способен in vivoвза имодействовать с С-концевой частью полипептида без образова-ния пептидной связи и восстанавливать ферментативную ак тивность(α-комплементация). В результате трансформации плазмидой pUCклеток, имеющих частичную делецию начальной части гена lacZ (Δ11–41 аминокислоты), происходит изменение их фенотипа от Lac− к Lac+.β-галактозидаза обладает способностью расщеплять субстрат Xgal(5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид) с образованиемокрашенного в голубой цвет продукта реакции. Поэтому колонии Lac+клеток, несущих плазмиду pUC, на среде с Xgal и индуктором lас-оперона IPTG (изопропилтиогалактозид), инактивирующим репрес-сор, окрашены в голубой цвет.Уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК локали-зованы в начале гена β-галактозидазы в составе полилинкера (после-довательности нуклеотидов, содержащей несколько перекрываю-щихся уникальных сайтов рестрикции). Интеграция чужеродной ДНКв последовательность полилинкера нарушает рамку считывания генаβ-галактозидазы и инактивирует фермент, в связи с чем колонии кле-ток, несущие рекомбинантную плазмиду, на питательной среде с Xgal,бесцветны. Поскольку векторы серии pUC содержат ген устойчиво-сти к ампициллину, отбор бактерий, несущих рекомбинантные плаз-миды, можно проводить одновременно по двум маркерам. На пита-тельной среде с ампициллином и Xgal вырастают только бактерии,устойчивые к антибиотику, т. е. содержащие плазмиду pUC, а средивыросших колоний лишь неокрашенные будут содержать вставкучуже родной ДНК.Еще более удобным является вектор pJET 1.2, сконструированныйфирмой Fermentas на основе вектора pUC19. Он был получен заменой5’-концевой части гена LacZ геном, кодирующим рестриктазу Eco47I.В отсутствие соответствующего метилирования ДНК, эндонуклеаза яв-ляется летальной для клеток E.coli хозяина. В гене этой эндонуклеазынаходится полилинкер, содержащий в том числе сайт для тупощепя-щей рестриктазы EcoRV. Коммерческий продукт представляет собойнабор для клонирования, ключевым компонентом которого является вектор pJET1.2, вскрытый по сайту EcoRV. В этот вектор могут быть за-клонированы продукты ПЦР. После трансформации на среде с анти-биотиком будут вырастать только клетки с плазмидой, содержащейвставку. В плазмидах без вставки восстанавливается структура генаэндонуклеазы, начинает вырабатываться токсичный для клетки белок,клетка гибнет.Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНКсложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинствоэукариотических векторов сконструированы как челночные. Инымисловами, эти векторы несут два типа сайтов инициации репликации идва типа селективных маркерных генов, одни из которых функциони-руют в Escherichia coli, a другие — в эукариотических хозяйских клет-ках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей,насекомых и клеток млекопитающих.

1.5. ТРАНСФОРМАЦИЯ

Процесс внесения ДНК в клетки бактерий называется трансфор-мацией. Способностью эффективно поглощать ДНК обладают толькокомпетентные клетки. В генной инженерии применяют два типа ме-тодик трансформации: химическую трансформацию и электропора-цию. Химически компетентные клетки характеризуются изменениемсвойств клеточной оболочки (уменьшается поверхностный заряд, по-вышается чувствительность к осмотическому шоку и т. д.). Для получе-ния компетентных клеток используют специально разработанныеприёмы (обрабатывают бактериальные клетки хлористым кальцием),которые обратимо повышают проницаемость клеточной оболочки.Электропорация — создание пор в бислойной липидной мембранепод действием электрического поля. Это явление используется в био-технологии для внедрения макромолекул (ДНК или РНК) в клетки жи-вых организмов. Явление электропорации основано на том, что привоздействии на клетки электрическим полем высокого напряженияпроисходит локальная деполяризация участков мембраны, сопрово-ждающаяся образованием пор. Как правило, к суспензии клеток в дис-тиллированной воде прикладывают импульсы электрического поляс напряжённостью от нескольких сотен до нескольких тысяч вольт на сантиметр и длительностью от десятков микросекунд до десятковмиллисекунд. Данная процедура проводится с использованием спе-циального прибора — электропоратора по протоколам, прилагаемымк нему. Получение электрокомпетентных клеток сводится к отмывкекультуры клеток от солей.Существенное значение для эффективности трансформации имеетструктура вектора. Наиболее эффективно трансформируют ковалент-но замкнутые кольцевые молекулы. Использование открытых колец(получающихся в результате однонитевых разрывов ДНК и снятиясупер спирализации ДНК) снижает эффективность трансформации при-мерно в два раза. Линеаризованные плазмидные ДНК сохраняют 0,1–10% трансформирующей активности.Эффективность трансформации невысокая, обычно трансформи-руется не более одной клетки из тысячи.После создания рекомбинантных молекул и отбора бактериальныхклонов, содержащих их, рекомбинантные молекулы принято прове-рять секвенированием.

1.6. СЕКВЕНИРОВАНИЕ

Секвенирование — это определение нуклеотидной последова-тельности ДНК. Для секвенирования ДНК в настоящее время исполь-зуют дидезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», раз-работанный Ф. Сенгером в 1977 году. Как и классический вариантСенгера, современное автоматическое секвенирование включает двестадии: проведение терминирующих реакций и разделение продук-тов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автомати-зирована лишь вторая стадия, т. е. разделение меченых фрагментовДНК в ПААГ (полиакриламидном геле), получение спектра эмиссиифлуорофоров и последующий обсчёт собранных данных.При дидезокси-секвенировании происходит гибридизация синте-тического олигонуклеотида длиной 17–20 звеньев со специфическимучастком одной из цепей секвенируемого фрагмента. Этот олигонук-леотид является праймером, поставляющим 3’-гидроксильную группудля инициации синтеза цепи, комплементарной матрице. Кроме ма-трицы и праймера в реакционную смесь добавляют ДНК-полимеразу, нуклеотиды (dNTP) и дидезоксинуклеотиды ddATP, ddTTP, ddGTP илиddCTP, каждый из которых мечен своей флуоресцентной краской.Если дидезоксинуклеотид включается в растущую цепь, рост цеписразу останавливается. Это происходит ввиду отсутствия группы3’-ОН, необходимой для роста цепи ДНК (рис. 11).

Рис. 11. Схема блокирования синтеза цепи ДНК при помощи ddNTP

В результате этого в пробирке при участии ДНК-полимеразы образуется уникальныйнабор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную по-следовательность и один из четырёх типов флуоресцентной метки(свой для каждого ddNTP). Далее в пробирки добавляют формамид длярасхож дения цепей и проводят электрофорез. Во время электрофоре-за в полиакриламидном геле луч лазера автоматического секвенаторав определённом месте геля возбуждает флуоресценцию красителей,и детектор определяет, какой нуклеотид терминировал цепь, мигрирующую в настоящий момент через гель. Современные при боры исполь-зуют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез, разделениепродуктов сиквенсной реакции в котором, происходит в тончай шихтрубках (капиллярах), заполненных полужидкой полиакриламиднойматрицей. Результаты секвенирования выводятся на экран компьюте-ра и могут быть сохранены в виде графического файла, представляю-щего собой последовательность пиков четырёх цветов (рис. 12), соот-ветствующих четырём нуклеотидам. Данная информация дублируетсябуквенным обозначением нуклеотидной последовательности.

Рис. 12. Схема представления сиквенса автоматическим секвенатором

Секвенирование — это метод, который должен быть использованна разных этапах генно-инженерного эксперимента: от выяснения пер-вичной структуры гена интереса до подтверждения соответствия при-внесённой последовательности, ожидаемой в трансгенном организме.В настоящее время для анализа сиквенсов существует множествокомпьютерных программ, большинство из которых имеется в свобод-ном доступе в сети Интернет. Многие из них можно найти на сайтеhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/.Так, алгоритм BLAST позволяет сравни-вать последовательности между собой, в том числе находить сиквен-сы, имеющие сходство с запрашиваемым, в базах данных известных насегодняшний день последовательностей.Итак, мы кратко рассмотрели принципы и сферу применения мето-дов генной инженерии. Обратимся теперь к их практическому освое-нию в рамках одного целостного эксперимента, посвящённого анали-зу видового состава сложной биологической смеси.

2. ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА

2.1. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ ЭКСПЕРИМЕНТА

Предлагаем познакомиться с методами генной инженерии, выпол-нив исследование на тему «Анализ состава фарша мясных полуфабри-катов генно-инженерными методами».Задача исследования: выяснить, какие компоненты, кроме мяса,использованы при приготовлении мясного фарша, методами анализаоставшихся в нём фрагментов ДНК. В основе работы будет лежать ана-лиз таксономически значимых районов последовательностей ДНК,которые будут подвергнуты клонированию и секвенированию.В настоящее время одними из наиболее популярных таких марке-ров являются последовательности внутренних транскрибируемыхспейсеров рибосомальных генов (ITS internal transcribed spacer). Мо-тив ITS локализуется между структурными генами рибосомальнойРНК 18S-5,8S-26S. Рибосомальные гены представляют собой единыйкластер ядерных генов, организованный в виде тандемно располо-женных повторов. Каждый кластер рибосомальных генов состоит изтранскрибируемой области (гены 18S, 5,8S и 26S рРНК) и внутреннихтранскрибируемых спейсеров, расположенных по обе стороны от5,8S рРНК, эти спейсеры называются ITS1 и ITS2 (рис. 13).Предполагается, что ITS, как любые некодирующие последователь-ности, накапливают мутации с высокой скоростью. Следовательно,они могут сильно отличаться даже у близкородственных организмов,поэтому их используют для филогенетических и биогеографическихисследований. Вместе с тем гены рибосомальных РНК, напротив, доста-точно консервативны. Поэтому на основе их последовательности мо-гут быть созданы универсальные праймеры, амплифицирующие ДНКширокого круга организмов. В настоящее время распространено ис-пользование праймеров, комплементарных участкам генов 18S РНК и 26S РНК, прилежащих к ITS1 и ITS2. С их помощью можно амплифици-ровать фрагмент, содержащий ITS1-ген 5, 8S РНК-ITS2. Это можно сде-лать, в том числе, и на смеси ДНК разных видов, но потом для анализаотдельных последовательностей необходима стадия клонирования.

Рис. 13. Схема организации кластера рибосомальных генов(стрелками указано расположение праймеров, используемых для амплификации кластера ITS)

Итак, для решения нашей задачи предлагается выполнить эксперимент по схеме, представленной на рис. 14.

Рис. 14. Схема экспериментаПриступим к описанию его этапов.

2.2. ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНОМНОЙ ДНК

Необходимое оборудование:водяная баня (нагретая до +56°^ С),центрифуги, дозаторы, фарфоровые ступки и пестики.Расходные материалы:микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл,наконечники для дозаторов на 1 мл, 200 мкл.Растворы:экстрагирующий буферэтанол 70%хлороформизопропанол.Ход работы:Приготовление экстрагирующего буфера.В колбе смешать:2 г ЦТАБ (цетилтриметиламмоний бромид), англ. CTAB (детергент,разрушает клеточные мембраны, образует комплексы с белка-ми и кислыми полисахаридами),28 мл 5M NaCl,4 мл 0,5M ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), англ. EDTA,pH 8,5 мл 2M Трис — HCl (гидроксиметил аминометан гидрохлорид),англ. Tris — HCl (2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol hy-drochloride), pH 8.Довести дистиллированной водой до 100 мл.Процедура выделения ДНК.0,5 г ткани поместить в ступку, тщательно растереть с помощью пестика с 1 мл экстрагирующего буфера.Перенести материал в микроцентрифужную пробирку объёмом 1,5–2 мл на 56–60º С на 30–40 минут, периодически перемешивая содержимое пробирки.После инкубации добавить равный объём хлороформа и оставить на 30–40 минут при комнатной температуре. Содержимое пробирки постоянно перемешивать.Центрифугировать в течение 5 минут при 3000 об./мин.Перенести верхнюю фазу в чистую пробирку и добавить 2/3 объёма изопропилового спирта, перемешать. Пробирки с содержимым оставить при комнатной температуре на 20–30 минут (можно дольше)для осаждения ДНК.Центрифугировать 10 минут при максимальных оборотах (10000 об./мин). Супернатант слить и промыть осадок 70%-ным этиловым спиртом. Центрифугировать при тех же условиях.Супернатант слить, осадок нуклеиновой кислоты высушить и растворить в воде.

2.3. ЭТАП 2. ПЦР И АНАЛИЗ ЕЁ РЕЗУЛЬТАТОВ

Постановка ПЦРНеобходимое оборудование: ДНК-амплификатор, дозаторы.Расходные материалы:микроцентрифужные пробирки на 0,5 мл,наконечники для дозаторов на 10 и 200 мкл.Реактивы:Препарат ДНК (полученный на этапе 1), Taq-полимераза и буферк ней, вода ампульная (деионизованная), раствор нуклеотидов (2 мМ),растворы олигонуклеотидов (ITS4-TCCTCCGCTTATTGATATGC, ITS5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG), минеральное масло.Ход работы:В микроцентрифужной пробирке смешать компоненты реакции впорядке, приведённом ниже:вода ампульная (деионизованная) 41 мклбуфер для полимеразы 10× с Mg 2+ (1–3 mM) 5 мклнуклеотиды 2 мМ 1 мклолигонуклеотиды от 2–20 пмоль в реакцию 2 × 1 мклTaq-полимераза 1–3 ед. активности на реакцию 0,5 мклДНК-матрица (1–1000 нг) 0,5 мклВ случае, если одновременно ставится несколько реакций, целе-сообразно делать сток, содержащий все общие для всех реакций ком-поненты.При использовании амплификатора «Терцик» в каждую пробиркудобавляют 2–3 капли минерального масла. При использовании ам-плификаторов с горячей крышкой этого не требуется.После смешивания компонентов реакции пробирки необходимопоставить в амплификатор и провести реакцию по программе:+95°^ С — 3 минуты 35 циклов (+95°^ С — 15 секунд, +58°^ С — 30 секунд, +72°^ С — 30 секунд) +72°^ С — 3 минуты.Анализ результатов ПЦР проводят методом гель-электрофореза.Приготовление агарозного гелядля разделения фрагментов ДНКНеобходимое оборудование: камеры для электрофореза, источ-ники тока, дозаторы, трансиллюминатор.Расходные материалы:наконечники для дозаторов на 10 и 200 мкл.Реактивы: ТРИС ( tris(hydroxymethyl) aminomethane), борная кис-лота, 0,5 М ЭДТУ (EDTA, Ethylenediaminetetraacetic acid) (pH 8), агароза,рас т вор бромистого этидия в воде (1%), буфер для нанесения (0,025%бром феноловый синий, 0,025 ксилен цианол в 30%-ном глицерине),продукты ПЦР с предыдущей стадии работы, маркер молекулярноговеса.Ход работы: Приготовление 5× буфера TBE. Растворить в 0,5 л дистиллированной воды: 54 г Tris-OH 27,5 г борной кислоты (boric acid) 20 мл 0,5 M EDTA (pH 8). Довести объём до 1 л.Для электрофореза необходимо приготовить 0,5× буфер ТВЕ. Наего основе приготовить 1%-ный агарозный гель. Для приготовленияПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА200 мл геля следует взять 20 мл 5-кратного буфера, 2 г агарозы, до-вести объём до 200 мл дистиллированной водой. Добавить 10 мкл1%-ного раствора бромистого этидия (3,8-диамино-5-этил-6-фенил-фенантридиум бромид, EtBr, Ethidium bromide).БРОМИСТЫЙ ЭТИДИЙ ЯВЛЯЕТСЯ СИЛЬНЫМ МУТА ГЕНОМ. ТАК ЖЕ СЧИТАЕТСЯ КАНЦЕРОГЕНОМ И ТЕРАТО ГЕНОМ. РАБОТАТЬ С НИМ И С РАСТВОРАМИ, СОДЕРЖАЩИМИ БРОМИСТЫЙ ЭТИДИЙ, СЛЕДУЕТ В НИТРИЛОВЫХ ПЕРЧАТКАХ.Плавить гель до однородного состояния на водяной бане или вмикро волновой печи, далее залить гель в электрофорезную камеру.При помощи гребёнки сформировать карманы для нанесения образ-ца необходимого объёма. После полимеризации геля заполнить каме-ру буфером (без агарозы), вытащить гребёнку. Образцы смешать с бу-фером для нанесения (5:1) и нанести в лунки. В одну из лунок нанестимаркер молекулярного веса.Провести электрофорез, установив напряжение, исходя из значе-ний 2–4 вольта на сантиметр длины камеры (на небольшую камерупорядка 100 В).Об успешности разделения фрагментов можно судить по движе-нию в геле красителей, являющихся компонентами буфера для нане-сения. Когда бромфеноловый синий (более подвижный краситель)пройдёт около 2/3 длины геля, можно приступать к визуализации ДНКпод воздействием ультрафиолетового света при помощи приборатрансиллюминатора.СЛЕДУЕТ ОБРАТИТЬ ВНИМАНИЕ НА ТО, ЧТО УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫЙ СВЕТ ВРЕДЕН ДЛЯ ЗРЕНИЯ, ПОЭТОМУ ТРАНС-ИЛЛЮМИНАТОРЫ СНАБЖЕНЫ ЗАЩИТНЫМИ ЭКРАНАМИ, КОТОРЫМИ НУЖНО ПОЛЬЗОВАТЬСЯ В ОБЯЗАТЕЛЬНОМ ПОРЯДКЕ. В КАЧЕСТВЕ АЛЬТЕРНАТИВЫ МОГУТ БЫТЬ ИСПОЛЬЗОВАНЫ СПЕЦИАЛЬНЫЕ ОЧКИ.При освещении ультрафиолетовымсветом бромистый этидийфлюоресцируеторанжевым цветом, интенсивность флюоресценцииувеличивается примерно в 20 раз при его связывании с ДНК (рис. 15).

Рис. 15. Агарозный гель, окрашенный бромистым этидием.

Визуализация ДНК ультрафиолетомВ результате описываемого эксперимента в геле должны наблю-даться фрагменты ДНК размером около 600 п. н.

2.4. ЭТАП 3. ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ (REAL-TIME PCR)

Оборудование:ДНК-амплификатор для проведения ПЦР в режиме реального времени.Набор микродозаторов от 1 до 200 мкл со сменными наконечниками.Микроцентрифужные пробирки на 200 мкл с прозрачными крышками.Источник тока и камера для проведения электрофореза в агарозном геле.Материалы:Препарат ДНК, полученный на этапе 1.ДНК тимуса теленка или другая балластная ДНК.Taq-полимераза, буфер для Taq-полимеразы, смесь нуклеотидов(см. этап 2).Смеси праймеров и зонды для гена лектина сои:F: GCCTCTGCCGACAGTGGTR: AAGAGCTGGTTGGAACGTCTT,Probe: FAM-CAAAGATGGACCCCCACCCACG-BHQ1Агароза, буфер ТBE 0,5×.Ход работы:Для большей выравненности образцов в отдельной пробиркесделать общий сток компонентов реакционной смеси, за исключени-ем препарата ДНК, как указано в табл. 1.Максимально точно перенести из пробирки со стоком в отдельныепробирки по 23 мкл реакционной смеси.(Пробирки не подписывать! Надписи могут пачкать лунки ампли-фикатора, а также затруднять детекцию сигнала.)Таблица 1Составление реакционной смеси для ПЦР в реальном времениКомпоненты реакционной смеси×1 пробирка 25 мкл×7 пробирок 175 мклВода18,8131,6Taq-буфер ×102,5 мкл17,5Смесь нуклеотидов 2мМ:0,5 мкл3,5Смесь праймеров и зонда (по 5 пмоль/мкл)1 мкл7Препарат ДНК2 мкл добавляется индивидуальноTaq-полимераза0,2 мкл1,4Приготовить разведения препарата ДНК в иммунологическомпланшете или на ленте парафильма согласно табл. 2.Таблица 2Приготовление разведений препарата ДНКНомерячейки NДобавить р-ра из ячейки N-1Доба-вить водыОтобрать р-ра в ячейку N+1Взять в реакциюРазбавление относительно предыдущего р-ра12 мкл2 мкл2 мкл2 мкл×2-кратное22 мкл2 мкл2 мкл2 мкл×2-кратное32 мкл18 мкл2 мкл2 мкл×10-кратное42 мкл18 мкл2 мкл2 мкл×10-кратное52 мкл18 мкл2 мкл2 мкл×10-кратноеДобавить в пробирки с реакционной смесью по 2 мкл приготов-ленного раствора ДНК.В пробирку No 6 добавить 2 мкл препарата ДНК тимуса теленка (илидругую балластную ДНК), эта проба используется в качестве отрица-тельного контроля.В пробирку No 7 добавить 2 мкл воды, эту пробу используем в каче-стве контроля на наличие контаминации.(Пробирки не подписывать! Надписи могут пачкать лунки ампли-фикатора, а также затруднять детекцию сигнала.)Установить пробирки в амплификатор. Запустить амплификациюпо программе:+95°^ С — 3 минуты45 циклов (+95°^ С — 15 секунд,+60°^ С — 30 секунд,+72°^ С — 30 секунд).Для повышения объективности имеет смысл проводить слепойконтроль: установку образцов в лунки прибора и визуализацию сигнала осуществляют разные люди. Установку производят бессистемно приотсутствии исследователя, производящего визуализацию и трактовкусигнала. При этом каждый из двух исследователей заполняет таблицу(табл. 3).Таблица 3Форма для оценки достоверности количественного методаопределения концентрации ДНК в исходном образцеNo образцаNo ячейки прибораРазбавление относительно исходного образца1×22×23×104×105×10По окончании реакции оценить значения пороговых циклов длякаждого образца. Сравнить таблицу, заполненную в ходе установкипробирок в амплификатор, с таблицей, заполненной на основаниизначений пороговых циклов по окончанию реакции.Проведение полуколичественного анализаПробирки из амплификатора перенести в штатив. Смешать по5 мкл каждого образца с 1 мкл буфера для нанесения.Провести электрофорез (см. этап 2).Для повышения объективности сделать слепой контроль: нанесе-ние образцов в лунки геля и визуализацию сигнала (оценку яркостифрагментов) осуществляют разные люди. Нанесение производят бес-системно при отсутствии исследователя, производящего визуализа-цию и трактовку сигнала. Каждый из двух исследователей заполняеттаблицу (табл. 3).Сравнить таблицы. Сделать заключение о достоверности метода.

2.5. ЭТАП 4. КЛОНИРОВАНИЕ ПРОДУКТА ПЦР В ВЕКТОР PJET 1.2

Выделение ПЦР фрагмента из геляНеобходимое оборудование: камеры для электрофореза, источ-ники тока, дозаторы, трансиллюминатор, центрифуга, низкотемпера-турная морозильная камера, морозильная камера на –20°С.Расходные материалы:наконечники для дозаторов на 10 и 200 мкл,микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл, стекловата, скальпели (лез-вия или специализированные наконечники для вырезания фрагмен-тов из геля).Реактивы:буфер ТВЕ 0,5×, агароза, раствор бромистого этидия(1%), буфер для нанесения (0,025%-ный бромфеноловый синий, 0,025ксилен цианол в 30%-ном глицерине), продукты ПЦР с предыдущейстадии работы, маркер молекулярного веса, 10 М ацетат аммония, эта-нол 96%-ный, этанол 80%-ный, ампульная вода.Ход работ:В камере для электрофореза залить гель толщиной 5–8 мм, ис-пользовать гребёнку с шириной зубца 7–10 мм.Весь объём смеси ПЦР смешать с 5 мкл буфера для нанесенияи нанести в лунку.Провести электрофорез (см. этап 2).На трансиллюминаторе расположить гель, надеть очки, непро-ницаемые для ультрафиолета, при помощи скальпеля или лезвиявыре зать фрагменты геля, содержащие целевой продукт ПЦР.Кусочки геля с ДНК поместить в заранее приготовленные колон-ки, показанные на рис. 16.Убрать колонки с гелем на –70°^ С на 30–40 минут или на –20°^ С наночь.Центрифугировать колонки при 4000–5000 об./мин в течение5–10 минут.Раствор, оказавшийся в нижней пробирке, смешать с 0,25 объё-ма 10 М ацетата аммония, четырьмя объёмами 96%-ного этанола и по-местить на –20°^ С на 30 минут.Центрифугировать пробирки (п. 8) при 10000 об./мин в течение15–20 минут.Слить супернатант, промыть осадки 80%-ным спиртом, высу-шить и растворить в 10 мкл воды.

Рис. 16. Схема колонки со стекловатой для выделения продукта ПЦР из агарозного геляЛигирование фрагмента в вектор pJET 1.2

Необходимое оборудование: термостат.Расходные материалы:наконечники для дозаторов на 10 и 200мкл, микроцентрифужные пробирки на 0,5 мл.Реактивы:набор для клонирования CloneJET PCR Cloning Kit (Fer-mentas), выделенный из агарозного геля ПЦР-продукт.Ход работы:В микроцентрифужной пробирке смешать компоненты реакциив следующей пропорции:2× реакционный буфер 5 мклпродукт ПЦР 1 мклвода 2,5 мклфермент для тупления концов ДНК 0,5 мклИнкубировать смесь 5 минут при +70°^ С, после чего поместитьв лёд.Добавить по 0,5 мкл векторной ДНК и лигазы.Инкубировать смесь 15 минут при комнатной температуре.

2.6. ЭТАП 5. ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИЙ

Необходимое оборудование:сухотельный термостат, термостати-руемый шейкер, ламинарный бокс, спиртовка, шпатель, пенопласто-вый контейнер для льда.Расходные материалы:наконечники для дозаторов на 10 и 200 мкл,полипропиленовые пробирки на 15 мл, чашки Петри.Реактивы:химически-компетентные клетки DH5alpha, лигазнаясмесь, среда Luna-Bertam (LB) (твердая и жидкая), ампициллин(100 мг/мл).Состав среды LB:пептон (триптон) 10 г, дрожжевой экстракт 5 г,NaCl 5 г, довести водой до 1 л. Для твёрдой среды LB необходимодопол нительно добавить 20 г агара на 1 л среды. Среду перед исполь-зованием следует проавтоклавировать (0,1 МПа, 40 мин).Ход работы:Достать из морозилки компетентные клетки, поместить их на ле-дяную баню на 5–10 минут.Добавить в пробирки с компетентными клетками лигазную смесьи инкубировать на льду 30 минут.Поместить пробирки в сухотельный термостат на +42°^ С на 40 се-кунд, после чего быстро перенести в лёд.Перенести содержимое микроцентрифужных пробирок в про-бирки объёмом 15 мл с 1 мл жидкой среды LB без антибиотиков.Поместить пробирки на 40 минут на термостатируемый шейкер(на +37°^ С).Подготовить в условиях ламинарного бокса чашки Петри с твёр-дой средой LB и ампициллином в концентрации 100 мг/л.Центрифугировать пробирки с культурой бактерий при 3000 об./минв течение 3–5 минут. Слить супернатант.ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТАВ условиях ламинарного бокса ресуспендировать (АККУРАТНО!)бактериальные клетки в остатках среды, перенести суспензию на чашкиПетри с твёрдой средой LB и аккуратно втереть при помощи шпателя.Поставить чашки Петри вверх дном в термостат на +37°^ С на ночь.

2.7. ЭТАП 6. ПЦР С КОЛОНИЙ

Необходимое оборудование:ДНК-амплификатор, дозаторы, ла-минарный бокс.Расходные материалы:микроцентрифужные пробирки на 0,5 мл,наконечники для дозаторов на 10 и 200 мкл, полипропиленовые про-бирки на 15 мл, жидкая среда LB с ампициллином 100 мг/л, сте-рильные зубочистки, пинцеты, чашки Петри с бактериальными ко-лониями.Реактивы:Taq-полимераза и буфер к ней, вода ампульная (деиони-зованная), раствор нуклеотидов (2мМ), растворы олигонуклеотидов,фланкирующих вставку в векторе (F: CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC, R:AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG), минеральное масло.Ход работы:В микроцентрифужных пробирках смешать компоненты реак-ции в порядке, приведенном ниже:вода ампульная (деионизованная) 41,5 мклбуфер для полимеразы 10× с Mg 2+ (1–3 mM) 5 мклнуклеотиды 2 мМ 1 мклолигонуклеотиды 2–5 пмоль в реакцию 2 × 1 мклTaq-полимераза 1–3 ед. активности на реакцию 0,5 мклВ условиях ламинарного бокса подготовить пробирки объёмом15 мл. Добавить в каждую пробирку по 3 мл среды LB с ампициллином,количество пробирок со средой должно равняться количеству проби-рок с ПЦР-смесью.Расположить перед собой чашку Петри с колониями, штатив с про-бирками, содержащими ПЦР-смесь, штатив с пробирками со средой.Стерильной зубочисткой, удерживаемой пинцетом, коснутьсяколонии бактерий, окунуть зубочистку в ПЦР-смесь, затем бросить еёв пробирку со средой. (Зубочистки стерилизуют предварительноавтоклавированием.)Повторить процедуру с оставшимися колониями.При использовании амплификатора «Терцик» в каждую пробиркус ПЦР-смесью добавляют 2–3 капли минерального масла. При исполь-зовании амплификаторов с горячей крышкой этого не требуется.Далее пробирки необходимо поставить в амплификатор и про-вести реакцию по программе:+95°^ С — 5 минут25 циклов (+95°^ С — 15 секунд,+58°^ С — 30 секунд,+72°^ С — 30 секунд)+72°^ С — 5 минут.Пробирки с зубочистками в среде LB поместить в термостатируе-мый шейкер на +37°^ С, 130 об./мин на ночь.Анализ результатов ПЦР проводят методом гель-электрофореза(см. этап 2).Ожидаемый размер продуктов ПЦР 650–700 п. н. Наличие такогопродукта говорит об успешности клонирования.

2.8. ЭТАП 7. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

Необходимое оборудование:центрифуги, дозаторы, pH-метр.Расходные материалы:полипропиленовые пробирки на 10–15 мл,микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл, наконечники для дозаторовна 1 мл, 200 мкл.Реактивы:раствор 1 (глюкоза 50 мМ, трис HCl 25мМ, ЭДТА 10мМ),раствор 2 (NaOH 0,2 N, SDS 1%),раствор 3 (3М ацетат калия, pH 5,2; для приготовления данного рас-твора следует растворить необходимое количество ацетата калияв воде до достижения приблизительно 2/3 окончательного объёма рас-твора, после чего довести pH концентрированной уксусной кислотой),этанол 70%, хлороформ, изопропанол, культура бактерий.Ход работы:Пробирки с ночными культурами бактерий центрифугировать10 ми нут при 3000 об./мин для осаждения клеток.Слить супернатант как можно полнее.Ресуспендировать клетки в 200 мкл раствора 1, перенести су-спензию в микроцентрифужную пробирку объёмом 1,5 мл.Добавить 400 мкл раствора 2, перемешать содержимое перево-рачиванием пробирки, подождать 2–3 минуты. Раствор должен статьвязким и просветлиться.Добавить 300 мкл раствора 3, перемешать. Должны выпастьдена турированные белки в виде белых хлопьев.Центрифугировать 10 минут при 10000 об./мин.Супернатант перенести в чистую пробирку, добавить равныйобъём хлороформа, плавно перемешивать в течение 15–20 минут.Центрифугировать 5 минут при 10000 об./мин. Верхнюю фрак-цию перенести в чистую пробирку, добавить 2/3 объёма изопропано-ла, осторожно перемешать. Инкубировать на холоде 20 минут.Центрифугировать 15 минут при 10000 об./мин.Слить супернатант, промыть осадок 70%-ным этанолом, высу-шить, растворить в 20–40 мкл воды.

2.9. ЭТАП 8. РЕСТРИКЦИЯ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

Необходимое оборудование:сухотельный термостат, дозаторы.Расходные материалы:наконечники для дозаторов на 10 и 200мкл, микроцентрифужные пробирки на 0,5 мл.Реактивы:раствор плазмиды (см. этап 7), рестриктазы XhoI и XbaI(Ferments), буфер Tango 2×, ампульная вода.Ход работы:Поскольку ДНК-вставка была залигирована в вектор по тупым кон-цам, вырезать ее можно только путём двойной рестрикции. Для этогонадо использовать рестриктазы, сайты которых располагаются с раз-ных сторон от места встройки нашего продукта. Рассмотрим картувектора (рис. 17).

Рис. 17. Карта вектора pJET 1.2

Примерами таких рестриктаз являются XhoI и XbaI.Для проведения рестрикции требуется смешать в пробирке компо-ненты реакции в следующей пропорции:вода 12 мклбуфер 2 мклпрепарат ДНК 5 мклрестриктаза XhoI 0,5 мклрестриктаза XbaI 0,5 мклИнкубировать 1 час при +37°^ С.По окончании рестрикции провести электрофоретическое разде-ление ее продуктов (см. этап 2). Присутствие на электрофореграммефрагмента ДНК длиной около 600 п. н. свидетельствует о наличии в век-торе целевой вставки.

2.10. ЭТАП 9. СЕКВЕНИРОВАНИЕ

Необходимое оборудование:ДНК-амплификатор c горячей крыш-кой, ДНК-секвенатор MEGABACE 1000 (или аналогичный), центрифугас охлаждением, укомплектованная ротором для 96-луночных планше-тов, дозаторы.Расходные материалы:планшеты 96-луночные для MEGABACE, на-конечники для дозаторов на 10 и 200 мкл.Реактивы:Препарат плазмидной ДНК (полученный на этапе 7),Taq-полимераза и буфер к ней, вода ампульная (деионизованная), ра-створ нуклеотидов (40–200 мкМ), растворы олигонуклеотидов pJET(F:CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC, R: AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG),минеральное масло, 10М ацетат аммония, спирт 96%-ный, спирт80%-ный, набор для секвенирования, матрица для секвенатора.Ход работы:Пробоподготовка.Секвенировать можно как плазмидную ДНК, так и продукты ПЦР.Вместе с тем отмечено, что сиквенсы получаются лучше при использо-вании в качестве матрицы продукта ПЦР, полученного в результате ам-плификации фрагмента плазмиды (в течение 15–20 циклов). По этойпричине есть смысл провести ПЦР на имеющихся у нас препаратахплазмидной ДНК как необходимый этап пробоподготовки к секвени-рованию. Для этого компоненты реакции смешивают в следующейпропорции:вода ампульная (деионизованная) 41 мклбуфер для полимеразы 10× с Mg 2+ (1–3 mM) 5 мклнуклеотиды 2 мМ 1 мклолигонуклеотиды 2–5 пмоль в реакцию 2 × 1 мклTaq-полимераза 1–3 ед. активности на реакцию 0,5 мклДНК-матрица 0,5 мклВ случае, если одновременно ставится несколько реакций, целе-сообразно делать сток, содержащий все общие для всех реакцийкомпонен ты.Поставить пробирки в амплификатор и провести реакцию по про-грамме:+95°^ С — 5 минут15 циклов (+95°^ С — 15 секунд,+58°^ С — 30 секунд,+72°^ С — 30 секунд)+72°^ С — 5 минут.После проведения реакции продукты очистить переосаждениемэтанолом с ацетатом аммония (как описано на этапе 4).Для секвенирования важным параметром считается точностьопределения концентрации ДНК-матрицы. Удобнее всего оцениватьконцентрацию ДНК на основании сравнения свечения в ультрафио-летовом свете электрофоретически разделённых исследуемых фраг-ментов с различными разведениями маркерной ДНК известной кон-центрации. Данный метод хорош тем, что является достаточно точнымдля определения концентрации ДНК, а также позволяет убедитьсяв отсутствии нецелевых фрагментов и существенной для сиквенса де-градации ДНК.Постановка реакции секвенированияВ каждой лунке планшета смешать компоненты реакции секвени-рования в следующей пропорции:ДНК-матрица (5–20 нг) 1 мклреакционная смесь (из набора) 2 мклпраймер (5 пмоль/мкл) 1 мклвода 1 мклЗаклеить планшет плёнкой, поставить в амплификатор и провестиреакцию по программе:35 циклов (+95°^ С — 15 секунд,+55°^ С — 15 секунд,+60°^ С — 1 минута).По окончании программы добавить в каждую лунку по 1 мкл 10 Мацетата аммония и 18 мкл 96%-ного спирта. Оставить на 30 минут при–20°^ С.Центрифугировать 40 минут при 3700 об./мин.Слить супернатант (удобнее отбирать его многоканальным до-затором), промыть осадки 100 мкл 80%-ного этанола, высушить, рас-творить в буфере для нанесения, прилагаемом к набору для секвени-рования.Запустить секвенатор MEGA BACE по инструкции к прибору. Про-чтение сиквенсов секвенатор осуществляет в автоматическом ре-жиме. По окончании анализа следует только скопировать файлыс резуль татами.

2.11. ЭТАП 10. АНАЛИЗ СИКВЕНСОВ

Анализ сиквенсов можно осуществить при помощи алгоритмаBLAST, доступного на сайте NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).Для этого надо выбрать функцию nucleotide blast. В результате от-кроется окно, показанное на рис.18.

Рис. 18. Вид интернет-страницы «Basic Local Alignment Search Tool» на сайте http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiВ

этом окне в область, указанную стрелкой 1, надо вставить сик-венс в текстовом формате, поставить метку, где указывает стрелка 2,нажать кнопку BLAST, на которую указывает стрелка 3.После чего откроется окно, в котором будут представлены вырав-нивания введённого сиквенса относительно наиболее близких сик-венсов из базы данных. Результаты будут представлены в виде, пока-занном на рис. 19.

Рис. 19. Выравнивание анализируемого сиквенса относительно имеющегося в базе NCBI

Проанализировав несколько десятков сиквенсов отдельных кло-нов, можно составить достаточно полное представление о том, какиекомпоненты были добавлены в мясной фарш.

2.12. ПРЕДСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Для закрепления полученных знаний по окончании экспериментаимеет смысл подготовить отчёт о проделанной работе.Отчёт должен включать следующие разделы: введение, материали методы, результаты и обсуждение, заключение.В разделе «Введение» необходимо сформулировать цели работы.В разделе «Материал и методы» следует подробно описать методики,которые были освоены в ходе практикума, в разделе «Результаты и об-суждение» нужно отразить, какие результаты были получены на раз-ных этапах работы и как они соотносятся с основной задачей исследо-вания. При обсуждении результатов рекомендуется учитывать данные,полученные группой студентов, проходивших практику, а не отдель-ными студентами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе эксперимента, описанного в данном руко-водстве, можно освоить основные методы генной инженерии дляреше ния простой и понятной задачи — выяснения состава мясныхполу фабрикатов. Вывод о наличии сои можно сделать на основе ре-зультатов ПЦР в реальном времени. Сиквенсы таксономически значи-мого района (ITS1-ген 5,8S РНК-ITS2), полученные из разных клонов,соответствуют продуктам ПЦР, полученным на ДНК разных видов, име-ющихся в смеси. Анализ сиквенсов из нескольких десятков клоновможе т дать достаточно много информации о том, какие биологиче-ские объекты присутствовали в смеси. В мясном фарше нам удавалосьнайти лук, батат, горчицу, фитопатогенные грибы и др.

ПРИЛОЖЕНИЕ

РОССИЙСКИЕ КОМПАНИИ, РЕАЛИЗУЮЩИЕ ОБОРУДОВАНИЕ И РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

Подробную информацию о компаниях, реализующих товары и услуги для генной инженерии, можно найти на сайте http://molbiol.ru/ Обобщённый список основных расходных материалов и фирм, где можно их приобрести, представлен в таблице: